Rakutuum

Tuum on kôigile eukarüootidele iseloomulik organell. Esimesena kirjeldas tuuma Brown 1831.a. Valgusmikroskoobis on ta kõige paremini nähtav raku osa, seetõttu oli ta rakkude uurimise algetappidel üheks suurima tähelepanu objektiks. Hôlmab ca 10% raku kogu ruumalast, sinna on koondunud peaaegu kogu rakus olev DNA.

Mitmesugused joonised rakutuuma kohta on saadaval aadressil: http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus.htm

Tuumaümbris

Tuum on ümbritsetud kaksikmembraaniga, millest välimine membraan on otseses ühenduses tsütoplasmavõrgustiku membraaniga ja seda vôib vaadelda kui tsütoplasma võrgustiku spetsialiseeritud osa.Tuuma sise- ja välismembraani vahelist osa nim. perinukleaarseks ruumiks, see on järelikult otseses ühenduses tsütoplasmavõrgustiku valendikuga. Sarnaselt tsütoplasma võrgustikuga võivad tuuma välismembraanile kinnituda ribosoomid. Tuuma sisemise membraani sisepinnal on ôhuke kiht nn. tuuma lamiine. Need on valgud, mis kuuluvad intermediaarseid filamente moodustavate valkude hulka. Lamiinid toetavad tuuma sisemist membraani seestpoolt. Rakutuumas paiknev kromatiinaine on lamiinide vahendusel seotud tuumamembraani sisepinnaga. Väljastpoolt on tuum ümbritsetud intermediaarsete filamentide vôrgustikuga. . Tuuma ümbrises on teatud vahemikega spetsiaalsed struktuurid, nn. tuuma poori kompleksid (nuclear pore complex- NPC), mis on moodustunud oktagonaalselt organiseeritud teatud kindlatest valkudest. (skeem) Tuumapoore moodustavaid valke nim. ka nukleoporiinideks. NPC-s osalevaid valke arvatakse olevat 60- 100 erinevat, üks poorikompleks koosneb ca 1000-st valgumolekulist.Tuumapoori valgud seovad tuumapoori servadel tuuma sise- ja välismembraani kokku. Vaatamata sellele ei difundeeru sisemembraanis olevad molekulid välismembraani ja vastupidi, ning sise- ja välismembraan jäävad oma koostiselt distinktseks.

Tuuma ja tsütoplasma vaheline ainete transport käib tuuma pooride kaudu. Transort läbi NPC on kas passiivne difusioon (ioonid, väikesed valgumolekulid) või aktiivne transport, mis vajab energiat ning teatud lubava signaali olemasolu. Iga üksik NPC toimetab nii importi kui eksporti.
Rakutuumas sisaldub peale DNA suur hulk valkusid (histoonid, DNA- ja RNA polümeraasid, geeni regulaatorvalgud, jne.), mis sünteesitakse tsütoplasmas ning mis peavad pääsema tuuma. Samal ajal on tervge hulk makromolekule ning neist moodustunud supermolekulaarseid komplekse, mis sünteesitakse tuumas, kuid mis funktsioneerivad tsütoplasmas (mRNA, tRNA, ribosoomide subühikud). Kui näit. tuumast eraldada mingit valku, ja süstida see raku tsütoplasmasse, siis see reakumuleerub kiiresti rakutuuma tagasi. Tüüpilisel imetajarakul on tuumaümbrises 3-4 tuh. poori. Transpordi intensiivsust läbi tuumapooride iseloomustavad järgmised ligikaudsed arvutused: Kui rakk sünteesib parasjagu DNA-d, siis on vaja ca miljon histooni molekuli importida iga 3 min järel, s.t., et iga poor peab laskma sisse 100 histooni molekuli minutis, et kindlustada vastsünteesitud DNA ôiget pakkimist histoonidega. Kui aga rakk sünteesib aktiivselt valku, siis on vajalik igal tuumapooril seest väljapoole lasta 3 ribosoomi subühikut minuti jooksul. Kas üks ja sama poor on võimeline läbi laskma nii tuumast väljuvaid kui sealt sisenevaid molekule, seda on selgitatud järgmise katse abil. Kasutades erineva suurusega kulla graanuleid, ühtedele pandud külge mingi nukleofiilne valk ning süstides selle tsütoplasmasse, teise suurusega graanulitele aga pandud külge RNA ning süstides tuuma, siis on näha, et üks ja sama poor võimaldab mõlemasuunalist liikumist.

Valkude import tuuma

Molekulaarbioloogiliste meetoditega on kindlaks tehtud, et läbipääsuloaks raku tuuma pääsemiseks on valkudel teatud aminohappeline järjestus, mis sisaldab tavaliselt positiivselt laetud aminohappeid Lys ja Arg . Seda järjestust nim. nukleaarse lokalisatsiooni signaaliks (NLS), NLS võib valgul paikneda ükskõik millises kohas. Info NLS järjestuse jaoks on kodeeritud vastavas geenis. Vale oleks mõista, et see järjestus pannakse külge hiljem, posttranslatsiooniliselt. Eukarüootne rakk määrab oma geenide poolt mitte ainult valgu struktuuri, vaid ka koha, kus valk rakus peab paiknema. Erinevalt signaaljärjestustest, mis on vajalikud transpordiks mitokondritesse, plastiididesse vôi endoplasmaatilisse retiikulumi, on NLS-d lühikesed, 5-14 am.hapet. NLS-na funktsioneerivaid järjestusi on palju, kuid kõik nad sisaldavad   aminohappeid Lys ja Arg. Laias laastus on NLS järjestusi kahte tüüpi: lühike 4-7-st aluselisest aminihappest koosnev järjestus või pikemad kaheosalised NLS-id, mis koosnevad 2-st aluseliste aminohapete blokist, mida eraldab ca 10 aminohapet. NLS kirjeldati esmakordselt SV40 viiruse poolt kodeeritud nn. T- antigeenil, mis on vajalik viirusliku DNA replikatsiooniks rakutuumas. T-antigeeni NLS koosneb näiteks: Pro-Pro-Lys128-Lys- Lys-Arg-Lys-Val. Leiti, et punktmutatsioon, mille tagajärjel vahetub üks aminohape teatud kindlas kohas (Lys128), elimineerib täielikult valgu sisenemise tuuma. NLS-järjestuse teiste aminohapete asendamine vähendab valgu importi tuuma. Kui näiteks taoline järjestus panna külge mõnele tsütoplasmas olevale valgule, saab teda sel moel muuta karüofiilseks, s.t. siis on ta võimeline tuuma poore läbima. Veelgi enam, kattes näiteks 20 nm läbimõõduga kolloidse kulla graanuli mingi karüofiilse (NLS-i sisaldava) valguga siseneb tuuma läbi tuumapooride niivõrd suur ja rakule võõras moodustis nagu seda on 20 nm kulla kolloidosake (tuumapoori läbimõõduks hinnatakse 10 nm !). Kolloidse kulla graanuleid kasutatakse selliste eksperimentide juures seetõttu, et kuld on elektrontihe aine ning elektronmikroskoobis hästi nähtav. Valgu transport läbi tuumapooride on temperatuurist sôltuv ning ATP hüdrolüüsi vajav protsess. Kui ATP-d pole vôi temp. on 0 *C, siis transporditav valk kinnitub tuumapooride tsütoplasmaatilisele poolele. Tuuma poori kompleksist väljapoole ulatuvad fibrillid arvatakse osalevat mingil moel seostumise etapis.

Kõik valgud ei pea tuuma pääsemiseks olema varustatud NLS- ga. See sõltub valgu suurusest. Alla 5000 Da molekulmassiga molekulid läbivad tuumapoore ilma mingi takistuseta, 17 000 Da molekulmassiga valgul läheb aega ca 2 min, et tema kontsentratsioon tsütoplasmas ja tuumas tasakaalustuks. Üle 60 000 Da molekulmassiga valk ei suuda aga ilma NLS-ta tuuma siseneda. Väikesed valgud ja ioonid läbivad NPC pidevalt avatud keskkanalit (9 nm). NLS-ga varustatud valgud aga põhjustavad keskkanali ajutist laienemist kuni 26 nm-ni.

Viimastel aastatel on kogunenud palju andmeid, et osa valke on võimelised sisenema tuuma ka ilma klassikalise NLS-järjestuse ja importiini abita. Siin võib olla tegemist sellega, et mingi valk võib komplekseeruda karüofiilse valguga ning satub seega tuuma karüofiilse valgu ‘kukil’. Välistatud pole ka muud võimalused valkude tuuma importimiseks. Näiteks onkogeenne valk b -kateniin arvatakse sattuvat tuuma sel moel, et ta seostub otse tuuma poori kompleksi valkudega ning ‘neelatakse’ seejärel alla.

Tuuma impordi mehanism erineb teistest membraantranspordi mehanismidest mitmete asjade poolest, näit. NLS järjestust ei lõigata pärast tuuma sisenemist valgu küljest ära, pärast seda kui valk on tuuma transporditud. Pôhjuseks see, et NLS-i läheb korduvalt tarvis. Kui rakk alustab mitootilist jagunemist, siis tuumamembraan lahustub ning tuumavalgud satuvad taas tsütoplasmasse. Kui tütarrakkudes formeerub uus tuumaümbris, siis on vaja tuumavalgud tsütoplasmast taas kokku korjata.

In vitro katsed on näidanud, et NLS üksi siiski ei ole piisav valgu tuuma transpordiks. Vajalikud on ka teatud tsütoplasma faktorid. Seda näitavad katsed isoleeritud tuumadega, mis ei impordi ka NLS-ga varustatud valke, kui aga lisada tsütoplasma ekstrakti, siis protsess käivitub. Tuntakse 5 erinevat tsütoplasmaatilist faktorit, mis osalevad valkude impordil tuuma. 1994.a. isoleeriti ühe sellise faktori, importiini, geen. Importiin on valk, mis tunneb ära NLS-i ning vahendab karüofiilse valgu seondumist tuuma poori valkudele. See valk koosneb kahest subühikust, mida tähistatakse a ja b . Esimene neist seostub vahetult NLS-ga, b -subühik aga aitab seostuda tuuma poori kompleksiga. Importiini mõlemad subühikud transporditakse kompleksis ‘laadungiga’ tuuma, kus see kompleks laguneb ning importiini subühikud saadetakse tuumast tsütoplasmasse tagasi.

Valkude eskport tuumast

Praeguseks on teada palju valke, mis lokaliseeruvad nii tuumas kui tsütoplasmas. Lähemal uurimisel on selgunud, et need valgud liiguvad süstikuna tuuma ja tsütoplasma vahel. Ka valgu väljumisel tuumast on vajalik teatud signaaljärjestuse olemasolu, mis erineb aga oluliselt impordiks vajalikust NLS-järjestusest. Ekspordi signaali on hakatud tähistama NES (nuclear export signal). Tuuma ekspordi signaalina toimivad järjestused, kus hüdrofoobsed aminohapped (Leu ja Ile) esinevad teatud kindlas asetuses. Näitena vaatleme ühe tuumor-suppressor valgu (APC) tuuma ekspordi signaali. See järjestus paikneb selle valgu aminoterminaalse otsa lähedal ja koosneb: L L E R L K E L N L DS . Rasvaselt märgitud on need leutsiinid, mille muteerimisel valgu eksport tuumast on takistatud. Teiste aminohapete (mis jäävad märgitud leutsiinide vahele) muutmine ei mõjuta valgu eksporti tuumast. Sarnane järjestus on leitud ka teistel valkudel, mis on võimelised tuuma ja tsütoplasma vahel liikuma. Torkab silma, et kõigile neile ekspordi signaalidele on iseloomulik leutsiini (või isoleutsiini) esinemine kindlate intervallidega (intervall 3, 2 ja 1 aminohapet). On teada ka vastav retseptorvalk, mis analoogselt importiinile tunneb ära ekspordi järjestust ning aitab valgud tuumast välja. Selle retseptori nimi on CRM1, kuid mida on hakatud importiini eeskujul ka eksportiiniks kutsuma. Paljude valkude tuumast eksporti on aidanud uurida seenest pärinev aine leptomütsiin B (LMB), mis seostub spetsiifiliselt CRM1 valguga ning takistab selle seondumist valgu ekspordi signaaliga. Kui näiteks rakke töödelda LMB-ga, siis kõik need valgud, mis käivad tuumast tsütoplasmasse, ei saa enam välja ning kuhjuvad raku tuuma.

Siinkohal võib tunduda arusaamatu, mis rakk kasutab niivõrd keerulist ja esmapilgul isegi mõttetud valkude transportimist tsütoplasmast tuuma ja siis jälle sealt tagasi. Miks ei võiks asi olla nii, et tuumas funktsioneerivad valgud saadetakse tuuma ning sinna nad jäävadki? Sellest arusaamiseks tuleb tähelepanu juhtida järgmistele asjaoludele. Esiteks, raku tuumas praegu teadaolevalt puudub võimalus valkude lagundamiseks. Kuid paljud valgud peavad funktsioneerima lühikese aja jooksul, ning seejärel saama lagundatud. Lagundamine aga toimub tsütoplasmas olevates proteosoomides. Seega tuuma sattunud valkude lagundamiseks tuleb nad sealt uuesti välja tuua. Teiseks, rakutuuma imporditud valkudest paljud käituvad transkriptsioonifaktoritena, mis reguleerivad teatud kindlate geenide ekspressiooni. Kuid tihti selliste sihtmärk-geenide ekspressiooni on tarvis ainult ajutiselt ning mõne aja pärast on otstarbekas selle geeni ekspressioon uuesti välja lülitada. Selleks ongi vajalik see valk tuumast uuesti eemaldada. Seega mingi transkriptsioonifaktori tuumas viibimine on tasakaaluline protsess tuuma impordi ja ekspordi vahel.

Samuti kui valgu import tuuma, on ka mRNA, tRNA ja rRNA eksport läbi NPC protsess, mis vajab metaboolset energiat ATP kujul ning teatud transpordi signaali. Isegi suhteliselt väikesed tRNA molekulid, mis tavaliselt on väiksemad kui 100 nukleotiidi, ei läbi NPC-d diffusiooni teel. Teatud nukleotiidide asendamisel tRNA molekulis tema võime tuumas väljuda väheneb. Kui katta 20 nm kulla graanulid väikeste RNA molekulidega (tRNA või 5S RNA) ning süstida need seejärel konna ootsüüdi tuuma, siis transporditakse graanulid kiiresti tsütoplasmasse. mRNA ekspordiks on oluline tema 5' otsas olev cap-struktuur, mis võimaldab komplekseerumist teatud valkudega, mis vahendavad eksporti tuumast.

Paljude rakkude tuumades on nähtav suur, distinktne moodustis, mida nim. tuumakeseks. Tuumakeses toimub ribosoomi subühikute formeerumine rRNA-st ja valkudest. Võib öelda, et tuumake on organell, mis moodustub tänu ribosoomide formeerumise protsessile. Elektronmikroskoopiliselt eristatakse tuumakeses 3 eri piirkonda: 1) fibrillaarne tsenter, sisaldab DNA-d mida parasjagu ei transkribeerita; 2) tihe fibrillaarne komponent, sisaldab sünteesitavat RNA-d; 3) granulaarne komponent, sisaldab formeeruvaid ribosoomi partikleid. Tuumake moodustub ribosomaalse RNA (rRNA) geene sisaldavate kromosoomilõikude ümber. Vastavat kromosoomi osa, kus see geeniklaster paikneb, nim. tuumakese organisaatori piirkonnaks (NOR). Inimese genoomis leidub NOR 5-l eri kromosoomil (13.,14.,15.,21. ja 22. kr.). NOR- d paiknevad kromosoomide lühikeste ôlgade otstes. Seega inimese diploidses rakus olevas tuumakeses on vastav DNA pärit 10-st kromosoomist, s.t. 10 kromosoomi NOR-d osalevad tuumakese moodustamisel. Kokku on inimese genoomis ca 200 rRNA koopiat, mis on tandeemselt organiseerunud. Iga rRNA geen annab ühesuguse transkripti, mis on tuntud kui 45S RNA (ca 13,000 nukl. pikk). Sellest tekib edasise protsessingu teel 3 erinevat RNA-d (28 S, 5.8 S ja 18 S RNA), mis lähevad ribosoomi kas suure vôi väikese subühiku koosseisu. Nende 3 RNA pärinemine ühest transkriptist kindlustab selle, et neid saab vôrdsel hulgal. Tuumakese suurus peegeldab tema aktiivsust ja ta varieerub oluliselt erinevates rakkudes ning muutub ka ühes ja samas rakus rakutsükli eri faasides. Tuumake on väga väike neis rakkudes, kus elutegevus on väga aeglane (sünteesiprotsessid aeglased) kuid vôib hôlmata kuni 25% tuuma ruumalast neis rakkudes, kus toimub intensiivne valgusüntees. Kui rakk alustab mitootilist jagunemist, siis tuumakese suurus väheneb ja kaob vastavalt sellele, et kromosoomid kondenseeruvad ja kogu RNA süntees lakkab. Kui pärast mitoosi rRNA süntees uuesti käima läheb, ilmuvad tuumakesed NOR-e kandvate kromosoomide vastavates osades. Seega inimese rakus pärast mitoosi formeerub 10 väikest tuumakest (diploidses rakus 10-l kromosoomil on NOR-id). Nad on harva eraldi nähtavad, sest nad kasvavad kiiresti ja ühinevad, moodustades ühe tuumakese. Elektronmikroskoopiline analüüs on näidanud, et nii kõrgemate kui madalamate eukarüootide rakkudes on tuumake seotud tuumaümbrisega, arvatvasti tuumapooride juures.

Molekulide liikumine tuumakesse ja sealt välja

Vaatamata pingutustele pole leitud järjestust, mis analoogselt NLS-ga suunaks valgud tuumakesse. On näidatud, et tuumakeses olevad valgud seostuvad sinna tänu interaktsioonidele juba seal olevate RNA-de või valkudega. Kui mingi tuumakese valgu teatud osa panna külge mingile suvalisele valgule, siis selline hübriidne valk akumuleerub tuumakesse. Tuumake ei ole membraani või mingi muu füüsilise barjääriga muust nukleoplasmast eraldatud. Ained satuvad sinna difusiooni teel.

Miks rakutuuma olemasolu on hea?

Tuuma olemasolu tôttu eukarüootidel on DNA replikatsioon ja RNA transkriptsioon täiesti eraldatud tsütoplasmas olevast translatsiooni masinavärgist ja teistest metaboolsetest protsessidest. Kuigi pole lôplikku vastust küsimusele, miks selline kompartmentaliseeritus on vajalik, vôib oletada, et valkude ja RNA vahetuse kontroll tuuma ja tsütoplasma vahel vôimaldab täiendavat geeni ekspressiooni ja DNA replikatsiooni kontrolli. Nimelt konkreetsete geenide ekspressioon sôltub kindlatest valgulistest transkriptsiooni faktoritest. On selge, et transkriptsiooni faktor peab pääsema tuuma, et oma ülesannet täita. Transkripts. aktivaatorite tuuma sisenemist aga on võimalik omakorda reguleerida sel moel, et NLS võib olla maskeeritud ning ta pole äratuntav tuuma impordi masinavärgi poolt. Maskeerimine võib olla saavutatud kas komplekseerumisega teiste valkudega või posttranslatsioonilise modifitseerimise (fosforüleerimine) abil. Väliskeskkonnast tuleva signaali toimel on võimalik transkriptsioonifaktori NLS-i kiire "lahtivõtmine"ning faktor pääseb seejärel rakutuuma. Selline mehanism võimaldab raku väliskeskkonnast tulevale signaalile kiiremat transkriptsioonilist vastust. Selles suhtes on hästi uuritud NF- kappa B tüüpi transkripsiooni faktorid, mille NLS on peidetud tänu seostumisele teiste valkudega. Teatud signaali toimel vabaneb faktor temaga kompleksis olevatest valkudest ning pääseb tuuma. Analoogslt toimivad steroid- ja kilpnäärme hormoonide retseptorid. Nende hormoonide retseptorid on tegelikult transkriptsioonifaktorid, mis pääsevad tuuma ainult siis, kui nad on hormooniga seostunud.

Kokkuvôte:

1. Rakutuuma ümbritseb 2 kontsentrilist membraani, mille sisepinnale kinnituvad tuuma lamiinid. Välismembraan on ühenduses tsütoplasmavôrgustiku membraaniga, s.t. et perinukleaarne ruum on otseses ühenduses ER kanalitega.