Täiendavat lugemist ER-i kohta koos joonistega saab vaadata aadressil: http://cellbio.utmb.edu/cellbio/rer2.htm
Tsütoplasmavõrgustik e. endoplasmaatiline retiikulum (ER) on ühekordse membraaniga
ümbritsetud terviklik kompartment, mis on iseloomulik kõigile eukarüootidele. ER-i
membraan moodustab üle poole kogu raku membraanistikust ja see eraldab ER-i luumeni (10%
kogu raku mahust) tsütosoolist. Seega ER-i membraan on barjääriks luumeni
ja tsütosooli vahel, ta vahendab teatud kindlate molekulide liikumist ühest
kompartmendist teise. ER mängib keskset osa biosünteesiprotsessides. ER-i membraanis
paiknevad ensüümid, mis sünteesivad kõikide teiste rakuorganellide membraanides
vajaminevaid lipiide ja kolesterooli. Samuti toimub seal steroidhormoonide süntees,
detoksifitseeritakse mitmeid kahjulikke aineid, modifitseeritakse sünteesitud valke. ER-i
membraan ja valkude süntees on omavahel olulisel määral seotud, nimelt ER-i membraan
seob ühe osa ribosoomidel sünteesitud valke.
Valgud, mis on määratud funktsioneerima ER-i enda membraanis või selle valendikus , Golgi kompleksi membraanis või selle valendikus, lüsosoomide membraanis või selle valendikus, raku välismembraanis või hoopis raku väliskeskkonnas, seostuvad oma N-terminaalse osaga ER-i membraani külge. Sünteesitavate valkude seostumine ER-ga algab juba enne seda kui tema süntees on täielikult lõppenud, s.t. toimub kotranslatsiooniline seostumine. ER-ga seostuvatel valkudel on N-terminaalses osas nn. signaalpeptiid e. liiderjärjestus. Kuna valgu süntees algab valgu N-terminaalsest osast, siis liiderjärjestus (16-30 aminohapet) valmibki kõige esimesena. Liiderjärjestuse alguses on paar +laetud aminohapet, millele järgneb 6-12 hüdrofoobset aminohapet. Liiderjärjestuse tunneb ära ja seostub sellega signaaliäratundja partikkel e. SRP (signal-recognition particle). SPR kujutab endast valgu ja RNA kompleksi. Selles osaleb 6 erinevat valku ja 1 väike RNA. SRP omakorda seostub ER-i membraanis oleva SRP retseptoriga. Kuna SRP seondumise ajal oma retseptoriga valgu tagumist otsa alles sünteesitakse ribosoomide poolt, siis tulemuseks on see, et ka ribosoomid kinnituvad ER-i membraani külge. (sünteesitava valgu, SRP ja SRP-retseptori vahendusel). Kui liiderjärjestus on SRP-ga seostunud, siis valgusüntees e. translatsioon peatatakse ajutiselt. Ilmselt on see oluline selleks, et oodata, kuni SRP seostub oma retseptoriga ja valk ei satuks tsütoplasmasse. Seda võib käsitleda kui julgestussüsteemi, sest ER-i valendikku sattuvatest valkudest paljud on hüdrolüütilised ensüümid, mis on määratud töötama lüsosoomides. Nende sattumine tsütoplasmasse võib olla rakule ohtlik.
Ülaltoodust tulenevalt on rakus seega kaks ribosoomide populatsiooni:
1) ER-seoselised
2) vabad (tegelikult on suur osa neist ribosoomidest seotud tsütoskeletiga, nii et päris vabad nad siiski ei ole)
Mõlemat tüüpi ribosoomid on identsed. Küsimus on vaid selles, millist valku parasjagu sünteesitakse (millist mRNA-d parasjagu transleeritakse). Ribosoom, mis antud hetkel on ER-ga seotud, võib järgmisena tegeleda sellise valgu sünteesimisega, mis ei oma liiderpeptiidi (ei seostu ER-ga) ja seega sel juhul ka see ribosoom ei kinnitu ER-le.
Ribosoomid, mis on seotud ER-ga, tekitavad rakus kompartmendi, mida nimetatakse karedapinnaliseks ER-ks (rER). ER-i seda osa, kus ribosoome pole, nimetatakse siledapinnaliseks ER-ks (sER).
Kotranslatsiooniliselt ER-i membraaniga seonduvad valgud.
Neid valke võib jagada kaheks alarühmaks:
1) Transmembraansed valgud. Need on sellised, millel on üks või mitu hüdrofoobsetest aminohapetest koosnevat transmembraanset domääni, mistõttu nad jäävad ER-i membraani kinni. Sealt edasi võivad nad liikuda vesiikulite membraani koostises kas Golgi kompleksi või lüsosoomide membraani koostisse või hoopis välismembraani koostisse.
2) Valgud, mis läbivad ER-i membraani ja satuvad ER-i luumenisse e. valendikku. Need
transporditakse edaspidi Golgi kompleksi või lüsosoomi või hoopis eksotsüteeritakse
rakust. Arusaadavalt jääb osa valke ka ER-i enda valendikku.
Pärast seda, kui sünteesitav valk on juba seondunud ER-i membraaniga, lõigatakse
liiderjärjestus valgu küljest ära, seda toimetab ER-i valendikus leiduv ensüüm
signaalpeptidaas. Valkude läbiminek ER-i membraanist toimub spetsiaalsete valguliste
translokaatorite kaasabil ja läbiminev valk ei saavuta oma õiget konformatsiooni enne,
kui ta on jõudnud ER-i valendikku. Üks neist valkudest, mis aitab parasjagu
sünteeitavat valku läbi ER-i membraani transportide, kannab nimetust TRAM (translocating
chain-associated membrane protein). Teine taoline
valk aga on tuntud nime all sec61.
Valdaval enamikul rakkudest on sER-i väga vähe või üldse mitte. Siledapinnalist ER-i on rohkem teatud kindlates rakutüüpides, kus tal on oma kindlad funktsioonid. Eriti hästi on sER nähtav rakkudes, kes on spetsialiseerunud lipiidide metabolismile. Näit. testises olevad Leydigi rakud sünteesivad kolesteroolist testosterooni. Neis rakkudes on rER-i kõrval hästi nähtav ka sER. Ka
hepatotsüüdid ehk maksarakud on hästiarenenud sER-ga rakud. Need on peamised rakud,
mis toodavad lipoproteiinseid partikleid, mille abil kantakse lipiide vereringe abil kehas
laiali. Vastavad ensüümid, mis toodavad partiklite lipiidkomponente, paiknevad sER-i
membraanis. Samas paiknevad ka ensüümid, mis tegelevad paljude lipiidides lahustunud
kajulike ainete detoksifitseerimisega. Detoksifitseerimise käigus muudetakse
rasvlahustuvad ained veeslahustuvateks, mis võimaldab nende väljutamist uriiniga. Kui
organismi satub palju kahjulikke aineid (näit. fenobarbitaali), siis vastuseks sellele
sünteesitakse suures koguses detoksifitseerimiseks vajalikke ensüüme ja sER-i hulk
mitmekordistub.
ER-i teine oluline funktsioon on kaltsiumi-ioonide salvestamine. Ca- ioonide vabanemine ER-st ja nende taas kokku korjamine on oluline raku reageerimisel paljudele väliskeskkonnast tulevatele signaalidele. Ca-ioonide ladustamine ER-is toimub spetsiaalsete kaltsiumit siduvate valkude kaasabil. Paljudes rakkudes on kaltsiumi salvestamiseks kohandatud ER-i kindel osa. Lihasrakkudes näiteks on rikkalikult sellist sER-i, mida nimetatakse sarkoplasmaatiliseks retiikulumiks. Ca-ioonide liikumine sarkoplasmaatilisest retiikulumist tsütoplasmasse ja tagasi reguleerib lihasraku kontraktsiooni ja relaktsiooni.
Enamik sekretoorseid ja membraanseoselisi valke alluvad pärast sünteesi nn. post-translatsioonilisele modifikatsioonile. Võib nimetada viit erinevat post-translatsioonilise modifikatsiooni tüüpi, millest kaks esimest ja viies toimuvad ainuüksi ER-s, kolmas ja neljas toimuvad peale ER-i ka Golgi kompleksis.
1. Disulfiidsildade moodustumine. See toimub rakus eranditult ER-is ning mitte kunagi tsütosoolis. Disulfiidsillad on iseloomulikud sekretoorsetele valkudele ning membraanseoseliste valkude eksoplasmaatilistele osadele. Nende moodustumine algab mõnikord juba siis, kui valgu C-terminaalset otsa alles sünteesitakse. Näiteks immunoglobuliini kerges ahelas toimub esimese kahe tsüsteiini vahel disulfiidsilla moodustumine juba siis, kui järgmist tsüsteiini polegi veel ribosoomi poolt sünteesitud. See tagab selle, et sillad tekiksid õigete tsüsteiinide vahele. Osade valkude puhul aga ei toimu sildade moodustumine järjestikuste tsüsteiinide vahel. Näiteks pro-insuliinil on sillad 1. ja 4., 2. ja 6. ning 3. ja 5. tsüsteiini vahel. Sel juhul toimub disulfiidsildade ümber moodustumine, s.t. et esialgu võib tekkida valesid sildu, mis aga hiljem korrigeeritakse. On teada ka ensüüm, mida nimetatakse valgu disulfiidi isomeraasiks ning see aitab disulfiidsildadel vajadusel ümber organiseeruda. Disulfiidsildade moodustumise tähtsust aitab mõista see, kui vaadata mis juhtub siis, kui neid ei sünteesita. Sel juhul valku ei saadeta üldse ER-ist edasi ning rakk ei suuda seda valku sekreteerida. See on ka peamine põhjus, miks paljusid eukarüootses rakus toodetud valke ei ole võimalik funktsionaalsel kujul bakterite abil toota, sest bakterirakus ei pakita neid õigesti kokku ning ei sekreteerita rakust.
2. Valkude õige kokkupakkimine. ER-i valendikus töötavad mitmed nn. chaperon-valgud, mille ülesanne on tagada ER-i sisenevate valkude õige kokkupakkimine. Ülalnimetatud disulfiidi isomeraas kuulub samuti nende hulka, sest disulfiidsildade õige moodustumine on samuti eelduseks õige konformatsiooni saavutamisele. Tuntud on ka nn. Bip- valk (binding protein), mis seostub pöörduvalt valgumolekuli hüdrofoobsete osadega ning takistab vale konformatsiooni ning agregaatide teket. Valkude õige kokkupakkumine ER-is on eeltingimuseks valkude edasitoimetamiseks Golgi kompleksi. Kui valk pole mingil põhjusel saavutanud õiget konformatsiooni, siis ta pumbatakse läbi ER-i membraani tagasi tsütosooli, kus ta lagundatakse proteosoomides. Endoplasmaatiline retiikulum toimib seetõttu justkui valkude kvaliteedi kontrolli punktina. Heaks näiteks siinkohal on üks inimesel suhteliselt sageli esinev pärilik haigus tsüstiline fibroos (mukovistsidoos), kus patsientidel puudub rakumembraanist üks ioonkanalina töötav valk CFTR. Selle haiguse kõige sagedasem põhjus on 508. positsioonis oleva aminohappe (milleks on fenüülalaniin) deleteerumine. Selle tulemusel ei suudeta seda valku ER-is õigesti kokku pakkida normaalsel kehatemperatuuril (kuigi 25 kraadi juures toimub see normaalselt) ning valk ei jõua välismembraani, kus ta peaks olema.
3. Valkude glükosüleerimine. Praktiliselt kõik membraanseoselised ning sekreteeritavad valgud on glükosüleeritud, s.t. et nad sisaldavad aminohapete külge kovalentselt seotud oligosahhariidseid ahelaid. Eristatakse kahte tüüpi glükosüleerimist: N-seoseline (toimub Asparagiini lämmastiku aatomi kaudu) ja O-seoseline (toimub Seriini või Treoniini hapniku aatomi kaudu). Teiste aminohapete külge suhkruahelaid ei panda. ER-is toimub ainult N-seoseline glükosüleerimine. Ka see protsess algab tavaliselt juba siis, kui valgu süntees pole veel täielikult lõpetatud. Endoplasmaatilises retiikulumis toimuva N-seoselise glükosüleerimise põhimõtteline skeem on kujutatud joonisel ..... See seisneb selles, et kõigepealt sünteesitakse valmis suur prekursor-oligosahhariid, mis koosneb komest glükoosi, üheksast mannoosist ning kahest N-atsetüülglükoosaminist. See struktuur on seotud spetsiaalse lipiidi, mida nimetatakse dolihooliks, külge. Seejärel tõstetakse see prekursor-oligosahhariid ühes tükis dolihooli küljest valguahelas oleva asparagiini külge. Seda toimetab ensüüm oligosahhariid-valk transferaas. Mitte päris kõik Asparagiini jäägid ei ole sobivaks substraadiks sellisele glükosüleerimiesele. On näidatud, et vajalik on Asparagiini esinemine järgmistes tripeptiidsetes kombinatsioonies: Asn-X-Ser või Asn-X-Thr (kus X võib olla ükskõik milline aminohape välja arvatud Pro). Peale seda, kui prekursor-oligosahhariid on valgu külge pandud, algab selle oligosahhariidi edasine töötlemine: kõigepealt eemaldatakse kõik kolm glükoosi jääki ning üks mannoosi jääk. Seejärel aga lisatakse ühekaupa mitmeid erinevaid suhkrujääke. Lõplik valgu glükosüleerimine leiab aset juba Golgi kompleksis. Erinevates rakutüüpides võib valgu glükosüleerimismuster olla väga erinev. Osadele valkudele seotakse külge väga pikad ja harunevad oligosahhariidahelad, mis võivad moodustada üle poole valgu molekulmassist.
4. Spetsiifiline proteolüütiline töötlemine. Paljud sekretoorsed valgud sünteesitakse rakus prekursoritena, s.t. ebaküpsete eellasmolekulidena, mida on vaja väiksemaks lõigata, et nad saaksid oma funktsiooni täita.
5. Mitmeahelaliste valkude moodustumine. Paljud sekretoorsed ja membraanseoselised valgud on oligomeerid, s.t. et nad koosnevad mitmest polüpeptiidahelast, mis tavaliselt on seotud üksteisega disulfiid-sildade abil. Selline valkude oligomeriseerumine toimub ER-is. Näiteid selliste valkude kohta võib tuua väga palju, aga piirdume siinkohal ühega, antikehade e. immunoglobuliinidega. See on valk, mida meie vereseerumis leidub suures hulgas: .....mg/ml. Kõige levinum on G-tüüpi immunoglobuliin (IgG), mis koosneb kahest identsest raskest ahelast ja kahest identsest kergest ahelast. Seega funktsionaalne IgG molekul koosneb neljast valgu ahelast, mis saavad omavahel kokku endoplasmaatilises retiikulumis.
Valkude transport ER-st Golgi kompleksi toimub membraaniga ümbritsetud transportvesiikulite abil. Need punguvad ER-i teatud piirkonnast, nn. transitsioonilisest elemendist. Selles piirkonnas ribosoome ER-i küljes pole. Seal pakitakse vesikulitesse kõik valgud, mis on sattunud ER-i valendikku või paiknevad ER-i membraanis. Osa valke aga peavad jääma ER-i funktsioneerima, näit. ülalnimetatud signaalpeptidaas, disulfiidi isomeraas jt. Miks neid ei pakita vesiikulitesse ning ei saadeta edasi? On selgunud, et neil valkudel on küljes lühike, neljast aminohappest koosnev järjestus Lys-Asp-Glu-Leu (ehk KDEL, kui kasutada ühetähelisi sümboleid). See järjestus ei hoia mitte valku ER-i valendikus kinni, vaid seda järjestust kandev valk saadetakse Golgi kompleksist tagasi, pakkides selle valgu eraldi transportvesiikulisse, see aga omakorda ühineb ER-i membraaniga ning annab oma laadungi sinna tagasi. KDEL järjestust nimetatakse ER-i hoidmissignaaliks (ER- retention signal). Kui see järjestus eksperimentaalselt lisada näiteks mõnele eksotsüteeritaval valgule, siis teda enam ei eksotsüteerita ning ta koguneb ER-i valendikku.
Lipiidide sünteesi läbiviivad ensüümid paiknevad ER-i membraanis, nende aktiivtsentrid aga on suunatud tsütoplasma poole, kus leiduvad vajaminevad metaboliidid. Süntees toimub 3- etapiliselt. Esimesena liidetakse ensüüm atsüültransferaasi poolt kaks rasvhappemolekuli glütseroolfosfaadile, tekkiv fosfatiidhape on vees lahustumatu ning jääb membraani bilipiidkihti. Sellega suureneb ER-i membraani lipiidse kaksikkihi välimise (tsütoplasmapoolse) kihi pindala. Järgnevates etappides modifitseeritakse tekkinud fosfatiidhapet, vastavalt sellele tekivad eri tüüpi fosfolipiidid. Bilipiidse kaksikkihi pindala suurenemine ainult ühelt poolt aga pole võimalik, sest siis tekiks lõpuks monolipiidne kiht. Lipiidimolekulide spontanne ülekanne ühest kihist teise (ehk nn. flip-flop ) on energeetiliselt väga ebasoodne ja see toimub äärmiselt väikese tõenäosusega. ER-i membraanis on aga ensüümid fosfolipiidi translokaasid e. flipaasid mis võimaldavad sünteesitud lipiidimolekulidel "hüpata" ka bilipiidkihi valendikupoolsesse külge.
Kui rakud purustada homogenisaatoriga, siis ER fragmenteerub ja tekitab väikesi vesiikuleid (100 nm diameetriga), mida nimetatakse mikrosoomideks. rER-ist pärinevad mikrosoomid on kaetud ribosoomidega, need paiknevad alati mikrosoomi välimisel pinnal. Seega mikrosoomi sisemus on biokeemiliselt identne ER-i luumeniga. Mikrosoome saab kergesti eraldada tsentrifuugimisel ja neid saab kasutada ER-is toimuvate protsesside uurimiseks. Biokeemiku jaoks kujutab mikrosoom endast lihtsalt ER-i vähendatud kuid autentset versiooni, kus toimuvad kõik ER-ile omased protsessid (valgu süntees, lipiidide süntees, valkude glükosüleerimine). Need mikrosoomid, mis pärinevad rER-ist ja on kaetud ribosoomidega, on raskemad kui ilma ribosoomideta mikrosoomid, ning neid on võimalik omavahel lahutada tsentrifuugimisel. Tuleb arvestada seda, et karedapinnalised mikrosoomid pärinevad küll rER-ist, kuid siledapinnalised mikrosoomid võivad pärineda ka raku välismembraanist, Golgi membraanist, endosoomide või mitokondrite-plastiidide membraanidest.
1) ER-is toimub kogu raku membraanikomponentide süntes (lipiidid, kolesterool),
2) ER seob teatud osa sünteesitud valkudest (need, mis kannavad liiderjärjestust).
3) ER-is toimub valkudel disulfiidsildade moodustumine ja nende õige kokkupakkimine, oligomeriseerumine, N-seoseline glükosüleerimine ja edasitoimetamine Golgi kompleksi.
4) sER-i leidub rohkem teatud spetsialiseeritud rakkudes, kus toimub lipiidide, steroidhormoonide süntees, kahjulike ainete detoksifikatsioon, kaltsiumi ioonide deponeerimine.