Rakubioloogia meetodid

Valgusmikroskoopia eri liigid.

Kujutis valgusmikroskoobis tekib valguse absorbeerumise tulemusena objektis. Kui vaadelda hariliku valgusmikroskoobiga elusaid, värvimata rakke, siis on nähtavad ainult suured detailid (näit. tuum jne.), mis erinevalt absorbeerivad valgust. Enamik raku komponente ei erine oluliselt üksteisest valguse absorbeerumise vôime poolest ja seetôttu on halvasti nähtavad ja ebakontrastsed. Raku eri komponendid erinevad üksteisest (küll vähe) valguse murdumisnäitaja poolest, mis tekitab valguskiirel faasinihke. Sellist faasinihet silm aga ei taju. Faaskontrastmikroskoobis on objektiivi monteeritud spetsiaalne plaadike, mis vôimendab tekkinud faasinihet ja muudab silmale nähtavaks (tekib kas hele vôi tume faaskontrast). Faaskontrastmikroskoobi tähtsus on selles, et ka värvimata (elusad) rakud on hästi nähtavad. Kasutatakse rakukultuuride uurimiseks. Väga lähedane faaskontrastmikroskoobile on Nomarski interferentsmikroskoop. Kasutatakse samuti elusate rakkude uurimiseks.
Tumeväljamikroskoobis suunatakse valgus kondensorist preparaadile viltu, nii et objektiivi ei jõua valgust juhul, kui preparaati pole (vaateväli on tume). Objektiivi satub valgus ainult sel juhul, kui preparaadis on valgustmurdvaid komponente. Lahutusvõime pole eriti hea aga see võimaldab vaadelda väikesi objekte, mis murravad tugevasti valgust. Objektid paistavad kui veetilgad päikese käes. Kasutatakse põhiliselt mikrobioloogias pisikeste objektide vaatlemiseks.
Polarisatsioonmikroskoopi kasutatakse selliste objektide uurimiseks, millel esineb nn. anisotroopia, s.t. koostisosade korrapärane orientatsioon, mis muudab polariseeritud valguse vônketasapinda. Polarisatsioonmikroskoop erineb tavalisest selle poolest, et preparaati tulev valgus on polariseeritud (läbib polarisaatorit), preparaati läbinud valgus aga peab läbima enne silmani jôudmist teist prismat e. analüsaatorit, mis laseb valgust läbi ainult ühes vônketasapinnas. Kui polarisaator ja analüsaator on omavahel risti, on vaateväli tume. Nähtavad on ainult objektis olevad anisotroopsed e. kaksikmurdvad struktuurid. Polarisatsioonmikroskoobi kasutamine bioloogias piirneb ainult üksikute eriküsimustega, sest anisotroopseid struktuure on rakkudes väga vähe. Näit. tselluloosi fibrillid paigutus taimeraku kestas, müofibrillid lihaskoes.
Fluorestsentsmikroskoopia pôhineb nähtusel, et paljud ained on vôimelised helenduma neis neeldunud valgusenergia toimel. Rakkudes leidub môningaid fluorestseeruvaid aineid, näit. klorofüll, porfüriinid, vit. A. Kuid fluorestsentsmikroskoopiat ei kasutata mitte looduslike fluorestseeruvate rakukomponentide uurimiseks, vaid kasutatakse fluorestseeruvaid värvaineid, millega värvitakse erinevaid rakukomponente. Väga laialt on levinud rakubioloogias nn. immuunfluorestsentsi meetod, mis pôhineb fluorestseeruvate värvainetega konjugeeritud antikehade kasutamisele. Enamlevinud fluorokroomidena antikehade märgistamiseks kasutatakse FITC (fluorestsiin-isotiotsüanaat), TRITC (tetrametüül-rodamiin- isotiotsüanaat ) PE (fükoerütriin) jt. Fluorestsentsmikroskoobis on valgusallikaks elavhôbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel). See valgus läbib nn. dikromaatset filtrit, mis laseb edasi teatud kindla lainepikkusega nn. ergastusvalgust. (Näit.492 nm FITC-i puhul). Ergastusvalguse toimel tekib fluorokroomis nn. emissioonvalgus, mis on alati pikema lainepikkusega kui ergastusvalgus. (FITC-i emissioonvalgus on 520 nm, s.t. roheline). Enne silma jôudmist läbib emissioonvalgus veel üht filtrit, mis püüab kinni vôimaliku lühilainelise kiirguse.
Fluorestsentsmikroskoopia on väga tundlik meetod, sest mikroskoobi vaateväli on tume ja tumedal foonil paistavad silma ka väga nôrgalt helenduvad objektid.
Konfokaalmikroskoopia on uus mikroskoopia liik, mis on tekkinud viimase 5-6 aasta jooksul. Vastav tehnoloogia töötati välja Inglismaal. Vôimaldab kôrgekvaliteedilist optilist kujutist ka suhteliselt paksust koematerjalist, ei ole vaja teha üliôhukesi lôike. Töötab nagu fluorestsentsmikroskoop, ta on varustatud vastava optikaga. Valgusallikaks on aga laserikiir. Pôhimôte: Kujutis tekib ainult sellest tasapinnast, mis on fookuses. Fookusest väljas olevad piirkonnad (mis tavalises mikroskoobis paistaksid ebateravate ja hägustena ning mis seetôttu segavad vaatamist) jäävad mustaks, neid ei näe. Uuritavast objektist tehakse suur hulk optilisi lôike, igast tasapinnast saadav kujutis salvestatakse arvutis pildifailina, mida on hiljem vôimalik ükshaaval analüüsida vôi sünteesida ruumiliseks kujutiseks. Konfokaalmikroskoop teeb põhimõtteliselt sama töö, mida meditsiinis teeb kompuuter-tomograaf. Mõlemad annavad uuritavast objektist kujutise kindlate tasapindade kaupa Konfokaalmikroskoobis töötavad valgusallikana korraga kuni 3 laserit, igaüks töötab oma kindlal lainepikkusel. Konfokaalmikroskoobi kasutusvôimalused on väga laiad, alates rakusisese Ca++ioonide vôi pH môôtmisest kuni rakustruktuuride pindala arvutamiseni.

Kôik eelpoolkäsitletud mikroskoobid võivad olla varustatud videokaameratega. Videosalvestus ei vôimalda mitte ainult reprodutseerida pilti monitoril, vaid ta aitab parandada lahutusvôimet, kui kontrastsus on madal; juhul kui fluorestsentsmikroskoobist saadav emissioonvalgus on väga nôrk, siis saab seda videosüsteemi abil vôimendada. Vôimalik on tekitada ka pildist negatiivkujutist, mis on oluline siis, kui teid huvitav osa jääb preparaadi tumedalt värvunud ossa ning on seetôttu halvasti vaadeldav. Kuna videokaamera poolt toodetud kujutis on elektrooniline, siis saab seda salvestada arvutisse ning töödelda vastavalt vajadusele. Selliselt saab muuta nähtavaks ka väga nõrgad kontrsti erinevused, mis muidu jääksid märkamatuks. Videoseadeldis on eriti vajalik ka näit. mikromanipulatsiooni jälgimiseks. Sel juhul ei ole vaja üheaegselt vaadata okularist sisse ning samal ajal liigutada manipulaatori nuppe, mis on ebamugav. Parem on jälgida kogu protseduuri kuvarilt. Väga efektne on vaadata videosalvestusi elusas rakus toimuvatest mitmesugustest liikumistest (organellide liikumine, endotsütoos, tsütoskeleti dünaamilised muutused, kromosoomide liikumine anafaasis jne. )

Läbivoolu tsütomeetria (flow cytometry)
See meetod vajab spetsiaalse aparaadi, nn. läbivoolu tsütomeetri (neid nimetatakse ka raku sorteriteks, kui nad on varustatud vastava sorteerimismooduliga) olemasolu. Selles aparaadis töötab laserikiir. Uuritav rakususpensioon juhitakse peene joana (nii, et rakud on üksteise järel) môôtekambrisse. Seal läbivad nad ükshaaval laserikiirt, mille tagajärjel kiir hajub ja peegeldub rakkudelt. Kui aga rakud on värvitud fluorokroomidega (näit. DNA on värvitud etiidium bromiidi, propiidium jodiidi vms., vôi on rakk märgistatud fluorestseeruvate antikehadega), siis laserikiire toimel tekib emissioonvalgus, mida môôdavad fotokordistid. Erinevalt fluorestsentsmikroskoobist, kus te saate tekkivat emissioonvalgust küll vaadata, aga mitte kvantitatiivselt môôta, vôimaldab laser-tsütomeeter môôta ka väga väikesi erinevusi: aparaadil on 1000 detekteerimiskanalit, mis registreerivad eri tugevusega emissioonvalgust. Läbivoolutsütomeeter registreerib igalt rakul korraga kuni 5 eri parameetrit: 3-l lainepikkusel emissioonvalgust, laserikiire otsehajumist (see iseloomustab rakkude joonmôôtmeid) ning hajumist külgsuunas (iselomustab raku sisestruktuuri. Saadud andmed salvestatakse kompuutri poolt ning neid on vôimalik soovitud kujul töödelda, trükkida välja graafikuid erinevates koordinaattelgedes (näit. flurestsents/raku joonmôôtmed; ) jne. Läbivoolutsütomeetriat kasutatakse palju rakutsükli uurimiseks. Nimelt DNA hulga alusel on vôimalik kindlaks teha rakutsükli eri faasides (G1, S, G2+M) olevaid rakke. Samuti kasutatakse tsütomeetrit igapäevases kliinilises praktikas näit. vereanalüüside tegemiseks jmt.
Läbivoolu tsütomeetreid tuntakse ka nimetuse all FACS (fluorecsence-activated cell sorter)

Monokloonsed antikehad
Metoodika loodi 1975.a. Köhleri ja Milsteini poolt , mille eest neile omistati 1984.a. Nobeli preemia.
Metoodika lahendas probleemi, kuidas saada erinevate antigeenide vastu täiesti homogeenseid antikehi suures koguses. (Antigeen - aine, mis on antud organismi immuunsüsteemile vôôras ja kutsub organismi viimisel esile immuunvastuse antikehade ja sensibiliseeritud lümfotsüütide näol. Immunvastuse produktid reageerivad spetsiifiliselt neid esile kutsunud antigeeniga.)
Metoodika rakuliseks aluseks on fakt, et iga üksik B-lümfotsüüt on vôimeline sünteesima ainult ühesuguste omadustega antikehi. B-lümfotsüüt on aga diferentseerunud rakk ja tema jagunemisvôime koekultuuris on väga piiratud. Selleks, et panna soovitud antikeha tootev B-lümfotsüüt jagunema, ühendatakse ta pahaloomulise kasvajarakuga, mille tulemusel tekib hübriidne rakk e. nn. hübridoom, millel on môlema eellasraku tunnused:
  • tal on piiramatu jagunemisvôime (kasvajaraku tunnus);
  • tal on soovitud spetsiifikaga antikehade sünteesi vôime (B-lümfotsüüdi tunnus).

    Monokloonsete antikehade saamise pôhimôtteline skeem:

    1) katselooma (hiir) immuniseerimine meid huvitava antigeeniga (mingi valk, hormoon, ensüüm; immuniseerida vôib ka tervete rakkudega, näit kasvajarakkudega, et saada kasvajarakule iseloomulike antigeenide vastu antikehi jne.)
    2) immuniseeritud hiire pôrnarakud (B-lümfotsüüdid) liidetakse (hübridiseeritakse) kasvajarakkudega (müeloomi e. plasmotsütoomi rakkudega).
    3) hübridoomrakkude selektsioon HAT-selektiivsöötmel. Selektiivsöötme pôhimôte: kasvajarakud, mis ei hübridiseerunud pôrnarakuga, surevad, sest nad on defektsed DNA sünteesi varutee eest vastutava ensüümi - HPGRT - suhtes. (vastava ensüümipuudega rakuliin on antud otstarbeks spetsiaalselt valitud, ei maksa arvata, et kôik kasvajarakud on sellise defektiga). DNA sünteesi peatee (de novo süntees) on aga blokeeritud selektiivsöötmes oleva aminopteriini poolt. Seetôttu antud söötmes saavad ellu jääda ainult hübridoomrakud, mille üks vanem oli pôrnarakk (sealt tuleb hübridoomile puuduv ensüüm HPGRT, ning ta kasutab DNA sünteesiks varuteed, milleks vajalikud ained - hüpoksantiin ja tümidiin on söötmesse juurde lisatud).
    4) Antikehade sünteesi testimine (tuleb üles leida see rakukloon, mis sünteesib tôepoolest teid huvitavaid antikehi)
    5) soovitud antikehasünteesiga rakuklooni rekloneerimine, osa materjali külmutamine;
    6) hübidoomi kasvatamine masskultuuris vôi hiire kôhuôônes astsiitkasvajana;
    7) antikeha puhastamine, kasutamine soovitud otstarbeks.

    Monokloonsete antikehade kasutamine

    Kasutatakse seal, kus on vajalik teatud kindla aine olemasolu tuvastamine mingis keerulises bioloogilises segus, näit. vereseerumis, uriinis, piimas jne. Väga palju kasutatakse monokl. antikehi rakubioloogias rakkudes teatud kindlate ainete tuvastamiseks, nende rakusisese lokalisatsiooni uurimiseks. Selleks vôib olla ükskôik milline teid huvitav raku komponent, ta vôib paikneda näit. raku membraanis (sel juhul öeldakse ka raku pinnaantigeen), tsütoplasmas, tuumas, kromosoomidel jne. Sel moel on avastatud pinnaantigeenid, mille alusel on vôimalik eristada erinevaid vererakkude alapopulatsioone; eristada kasvajarakke normaalsetest rakkudest, mis vôimaldab organismis kasvaja olemasolu varakult kindlaks teha;
    Antikehade abil määratakse ka viiruslike ja bakteriaalsete antigeenide olemasolu organismis, tehakse kindlaks inimesel mitmesuguste pärilike haiguste olemasolu, kui sellega kaasneb organismis mingi aine (hormoon vm.) puue vôi üleproduktsioon (näit. kaasasündinud kilpnäärme alaarengut e. hüpotüreoosi tehakse vastsündinutel kindlaks vastavate hormoonide määramise abil); monokloonsetel antikehadel baseeruvad ka raseduse kindlakstegemise testid, mis määravad uriinist hormooni koorioni gonadotropiini (hCG) olemasolu. Antikehi kasutatakse ka ainete puhastamiseks keerulistest segudest - sellel pôhineb immuunoaffiinsuskromatograafia meetod.

    Lektiinide kasutamine rakubioloogias

     Lektiinid on glükoproteiidid, mis seonduvad spetsiifiliselt teatud oligosahhariidste järjestustega. Lektiinid on mitteimmunoloogilise päritoluga valgud, neid leidub looduses alates viirustest ja bakteritest kuni imetajateni. Enamik lektiine on avastatud taimedest, eriti liblikôieliste seemnetest. Tuntakse üle 600 erineva lektiini, igaühel neist oma kindel spetsiifika teatud suhkrujärjestuste suhtes. Lektiine tähistatakse tavaliselt kolmetähelise lühendiga, mis viitavad organismile, kust ta on eraldatud, ning juurde märgitakse ka äratuntav suhkurjärjestus. Näited: LCA (Lens culinaris) D- Man -D-Glc PNA (Arachis vulgaris) Gal-GalNAc Kuna rakkude glükokaalüksis on hulgaliselt glükoproteiide, siis vastavate suhkurkomponentide uurimiseks kasutataksegi lektiine. Nad sarnanevad selles môttes antikehadega, et on vôimelised teatud struktuure spetsiifiliselt ära tundma. Sarnaselt antikehadele on vôimalik lektiine märgistada fluorokroomidega, ensüümidega jne. Lektiinid avastati 1888.a. Stillmark'i poolt Tartu Ülikoolis. Esimeseks avastatud lektiiniks oli ritsiin. Lektiinidel on oma kindel funktsioon, paljud taimsed lektiinid on väga toksilised, mis kaitseb ilmselt taime ärasöömise vastu; kõrgematel organismidel osalevad lektiinid rakkudevahelistes kontaktides; meenutagem, et loomse raku glükokaalüksis on palju glükoproteiide, mille suhkurkomponente tunnevad ära teiste rakkude membraanides olevad lektiinid.